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第五节 吸收放散试验（第1页）

第五节吸收放散试验

一、吸收试验

吸收试验

吸收试验（Absorptio）用于自身抗体的吸收，一份血清中有几种特异性抗体的分离及鉴定，弱抗原的证实和低浓度抗体的浓缩。操作上可有所不同，必要时和放散试验结合使用。

1．冷自身抗体吸收冷自身抗体（Coldautoantibodies）存在较为普遍，效价一般不高，冷凝集素病患者，效价一般在64以上。由于其干扰ABO血型鉴定、配血甚至掩盖检测血清中有临床意义的同种抗体（Alloantibodies），因此要用自身红细胞吸收除去血清的自身抗体，提供合适的血清用于ABO反定型、配血试验和抗体检查。

（1）标本采集：指有冷抗体的标本采集。采集两份血标本，一份抗凝标本，置37℃温育，防止冷抗体吸收到红细胞上。另一份非抗凝标本，置4℃，让红细胞充分吸收冷自身抗体，之后立即分离血清。

（2）吸收方法：将温育10分钟以上的抗凝血，用37℃生理盐水洗涤3次，分置3支试管中，每支约1ml红细胞，将2ml待检自身血清加入其中一支试管中，混弱，置4℃孵育30～60分钟，其间摇动数次，使其充分吸收。1000g离心5分钟，将血清转入第二支试管中，4℃孵育30分钟，作第二次吸收。如仍有自身凝集，再作第3次吸收。冷抗体经2～3次吸收，都会吸收干净。必要时用二期酶法处理自身红细胞后做吸收试验。

2、温自身抗体吸收温自身抗体（warmautoantibodies）的患者红细胞表面包被了自身抗体，血清中也可能存在这种游离抗体。这种红细胞可能在试剂血清（如抗A，抗B）中发生凝集，甚至在盐水介质中自凝，干扰了血型鉴定、抗体检出和配血试验。因此必须先去除红细胞上的自身抗体，再用自身红细胞吸收血清中的温自身抗体。去除红细胞上包被的温抗体要比去除冷抗体难得多。

（1）热～酶处理细胞法：将2ml患者红细胞用生理盐水洗涤4次，每次尽可能吸净上层盐水；加上与压积细胞等体积的6%牛蛋白盐水溶液，混匀，置56水浴轻轻摇动3～5分钟，在预温的离心管中，以1000g离心2分钟，收集上清液作放散液用。向

积红细胞中加入木瓜酶溶液1ml，混匀，37℃温育15分钟，洗涤红细胞3次，第3次1000g离心至少5分钟，并尽可能吸净上层盐水，将红细胞分为两份。在一份红细胞中加入患者血清2ml，混匀，37℃温育30分钟，1000g离心2分钟，上层血清转入另一红细胞中，重复一次。

（3）二硫苏糖醇-木瓜酶处理法：所用试剂由二硫苏糖醇和木瓜酶组成。其中二硫苏糖醇能提高Ig分子对蛋白酶的敏感性，在酶的作用，免疫球蛋白分子失去了完整性，并与红细胞脱离。而蛋白酶又对红细胞表面作了处理，增强了对自身抗体的吸收能力。

试剂配制：取1g二硫苏糖醇溶于32。4mlPH7。3的PBS中，制成0。2M的二硫苏糖醇溶液，分装后置-20℃以下保存。取0。2M的二硫苏糖醇溶液2。5ml加0。5ml半胱氨酸活化木瓜酶溶液，再加2mlPH7。3的PBS即成。

方法：在两支各有1ml压积红细胞的试管中，分别加2ml二硫苏糖醇～木瓜酶试剂，混匀，37℃温育30分钟，用生理盐水洗3次，第3次1000g离心至少5分钟，并尽可能吸净上清液。向一支处理过的红细胞试管中加2ml待检血清，37℃温育30分钟，1000g离心2分钟，将血清转入另一支试管中，重复一次。、

上述两种方法两次吸收后的血清，通常都可除净自身细胞做间接抗球蛋白试验来检查自身吸收的效果，但自身细胞本身要直接抗球蛋白试验阴性。

吸收以后的血清用来检测同种抗体的活性和选择没有同种抗体相应抗原的红细胞进行配血。

3．实验室吸收试验有些实验常常需要做吸收试验。具体如下：（1）一份血清怀疑有几种特异性抗体，又无足够多的试剂细胞供选择做鉴定时，可选择与其中某抗体相应的试剂细胞作吸收，将吸收后的血清和吸收细胞的放散液作进一步鉴定，可以将几种特异性抗体鉴定清楚。（2）一份血清经鉴定混合有两种特异性抗体，可用吸收试验分离。（3）某个体红细胞的一种抗原很弱，如AM，AEL，与相应抗体不产生可见的凝集现象，但能吸收相应的抗体，可用已知效价的相应抗体与该个体红细胞作用后，再测抗体效价，如效价下降两个稀释度以上，有吸收作用，证实该抗原的存在。（4）一份血清中某种抗体的含量太低，无利用价值，可用大量的血清与适量的红细胞作吸收，然后放散在小量的介质中，使抗体得到浓缩。

吸收试验中所用的红细胞最好用新鲜红细胞。冷抗体吸收试验过程要防止温度上升，冷抗体释放。温抗体吸收试验过程要防止环境温度过高，引起抗体的释放。

二、放散试验

&ion）和释放意义相同，又称洗脱，是从红细胞上把抗体解离下来。用于作自身吸收、血型鉴定和交叉配血用的红细胞以及新生儿溶血病检测及抗体特异性鉴定，或制备单特异性抗体。

放散试验主要是研究温抗体的放散，有物理方法和化学方法二种。热放散法、冻融放散法、超声放散法、微波放散法等是物理方法。乙醚法、氯仿法、二氯甲烷法、三氯乙烯～三氯甲烷法、磷酸氯哇法等是化学方法。常用方法如下：

1热放散法用生理盐水充分洗涤红细胞4次，压积，取1体积压积红细胞加等体积生理盐水（或6%牛白蛋白，或无抗体活性AB血清），置56℃水浴10分钟，其间不断摇动，然后在预温的离心管中以1000g离心2分钟，立即将上层红色放散液转移到另一试管中，根据需要进行不同的试验，热放散法比较简单，主要用于ABO血型系统抗体引起的新生儿溶血病。

2．乙醚放散法用生理盐水充分洗涤红细胞4次，取1体积压积红细胞加1体积生理盐水（如放散出的抗体需要保存改用6%牛白蛋白或AB血清），再加2体积分析纯（或麻醉）乙醚，塞紧管口，用力颠倒摇动1分钟，小心放气减压，置37℃30分钟，每10分钟摇动1次，1000g离心10分钟，弃去上层乙醚，通过中间基质层，吸出下层有血红蛋白的释放液于另一试管中（不塞）置37℃，驱除残存的乙醚备用。乙醚放散法主要用于红细胞上的各种IgG抗体的放散。

3．二磷酸氯喹法当红细胞包被IgG抗体，直接抗球蛋白试验阳性时，不能用酶法或间接抗球蛋白试验做血型鉴定，需要洗脱掉红细胞上的抗体，但同时还要保持红细胞膜的完事性和抗原活性可以使用氯喹法。

氯喹溶液的配制：称20g二磷酸氯喹溶于100ml蒸馏水中，用INNaOH调PH至5。1，

4℃保存。

方法：取0。2ml洗涤压积红细胞加0。8ml氯喹溶液，混匀，置室温孵育30分钟，取1滴红细胞悬液用盐水洗涤4次，直抗试验阴性，可洗涤全部处理的红细胞备用；直抗阳性，放散未完全，须重复孵育并检测。但需要注意的是：①总的孵育时间不要超过2小时，否则会引起溶血和抗原丢失。②设立有已知抗原的对照细胞，以证实在处理过程中未丢失抗原。③用本方法处理的细胞不宜用盐水反应性抗体和盐水稀释的抗体来检测抗原。